Gastroenterología, Parasitología Artículo acreedor al Premio Nacional de Medicina, Edición 2000 Fecha de publicación: marzo de 2001 Detección de antígeno de Giardia lamblia en eluídos de materia fecal humana por ELISA utilizando anticuerpos policlonales. La identificación de Giardia en materia fecal humana puede fracasar como consecuencia de la eliminación intermitente de quistes del parásito en las heces; no obstante, puede recurrirse a la detección de antígeno de Giardia en materia fecal para comprobar que el hospedero se encuentra infectado. Se estandarizó y evaluó el ensayo inmunoenzimático ELISA utilizando anticuerpos policlonales anti-quiste y anti-trofozoíto de cepas colombianas de Giardia desarrollados en conejos para la detección de antígeno de Giardia en materia fecal humana. Se purificaron quistes de Giardia, a partir de heces humanas mediante gradientes de sucrosa y Percoll para infectar gerbils, modelo animal para estudios de Giardiasis, y obtener trofozoítos del parásito. Se inocularon conejos, independientemente, con antígeno de quiste y trofozoíto de Giardia con la finalidad de obtener anticuerpos policlonales anti-quiste y anti-trofozoíto del parásito. Se realizó una mezcla de anticuerpos policlonales anti-quiste y anti-trofozoíto de Giardia, en una proporcion 1:2, respectivamente, previa purificación de éstos mediante precipitación secuencial de ácido caprílico y sulfato de amonio. Se elaboró un conjugado con parte de los anticuerpos policlonales uniéndole a éstos fosfatasa alcalina. Se realizó el diagnóstico parasitológico en 196 heces humanas. Se encontró quistes y/o trofozoítos de Giardia en 69 coprológicos (muestras positivas); en 56 materias fecales no hubo presencia de ningún parásito intestinal (muestras negativas) y en 71 hubo presencia de parásitos intestinales diferentes a Giardia (muestras negativas - reacción cruzada). La concentración óptima de anticuerpos policlonales fue de 40 mg/ml y la dilución óptima de conjugado fue de 1:400. El valor de absorbancia (punto de corte) que diferenció una muestra negativa de una positiva fue de 0.24. Los parámetros de la prueba fueron: sensibilidad: 100%, especificidad: 95%, valor predictivo positivo: 91% y valor predictivo negativo: 100%. La prueba de ELISA estandarizada y evaluada en la presente investigación puede ser utilizada como herramienta diagnóstica de la presencia de Giardia en eluídos de materia fecal humana.
Publicado en Revista Médica Sanitas, Volumen 2, Número 2
Autores: Dr. Rafael Guerrero Lozano, Dra. Sofía Duque, Dra. Adriana Arévalo, Dr. Ruben Santiago Nicholls.
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Introducción |
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La Giardiasis es una enfermedad intestinal causada por el protozoo, flagelado, Giardia lamblia, que se encuentra distribuido en el mundo. La prevalencia del parásito depende de: la sensibilidad del método de detección, la localización geográfica y la población estudiada (1). En Colombia, las prevalencias de la Giardiasis, según las dos encuestas nacionales de morbilidad, han sido del 12.2% en la primera, 1969 (2) y del 13.7% en la segunda, 1980 (3). La prevalencia en niños colombianos entre 1 - 4 años en 1996 fue del 21.2% (4) y en 1998 del 28% (5). La Giardiasis se transmite mediante la ingestión de los quistes, que son infectantes tan pronto salen en las materias fecales. Su diseminación se hace a través de manos sucias, aguas y alimentos contaminados y por cualquier otro mecanismo que permita la contaminación fecal. La Giardiasis puede presentarse en forma epidémica por contaminación de acueductos, aún en aquellos con tratamiento de cloración (6). La Giardia tiene un ciclo de vida simple con dos estadíos: el quiste, la forma infectante y el trofozoíto, el responsable de la patología (7). La identificación de quistes y/o trofozoítos de Giardia se realiza en muestras de materia fecal (una muestra o coprológico seriado), aspirado duodenal, impronta y biopsia de intestino delgado (8, 9). Existe, sin embargo, una gran controversia en todo el mundo respecto al diagnóstico parasitológico. Se ha informado que la sensibilidad de identificación del parásito en materia fecal incrementa hasta el 85% cuando se realiza coprológico seriado (8). En aspirado duodenal oscila entre 25 - 100% y en biopsia e impronta, es del 100% en pacientes que previamente se conocía presentaban diarrea y/o síndrome de malabsorción y las muestras provenían de diferentes pacientes (10). En Colombia, Guerrero y Col. (11) evaluaron la sensibilidad para identificar Giardia lamblia en coprológico seriado, directo y método de concentración, aspirado duodenal, biopsia: impronta e histopatología, provenientes del mismo individuo, en pacientes que eran enviados a estudio de gastroenterología. La sensibilidad de identificar Giardia lamblia fue del 17 - 22% en aspirado duodenal, 39% en biopsia, 50% en impronta y en coprológico seriado incrementó del 67%, primera muestra de heces, hasta el 78%, tercera muestra de materia fecal. Las heces se pueden obtener fácil, a diferencia del apirado doudenal y biopsia, que requieren de métodos invasivos, incómodos y costosos para el paciente. La mejor muestra para identificar el parásito es la muestra de materia fecal. Sin embargo, no se obtiene el 100% de sensibilidad en la identificación de quistes y/o trofozoítos de Giardia lamblia en heces por razones inherentes al parásito como son: su variabilidad genética y la excreción intermitente de quistes y/o trofozoítos del parásito (12). Este fenómeno puede obviarse realizando la detección de antígeno de Giardia en materia fecal utilizando anticuerpos policlonales desarrollados contra cepas del parásito circulantes en la región geográfica de su aplicación. Los antígenos de Giardia que se detectan en heces, corresponden a los metabolitos de excreción/secreción del parásito. Los métodos para detección de antígeno de Giardia que se han utilizado son: la contrainmunoelectroforesis (CIE) (13), el ELISA (14, 15) y el inmunoensayo enzimático de punto (dot-ELISA) (16). La sensibilidad de los métodos varía de 88-98% utilizando CIE, del 68-100% mediante ELISA y del 92% con el dot-ELISA. La especificidad de la CIE, ELISA y dot-ELISA oscila entre 90-97% y del 81-100% para las dos primeras, y del 100% para la última. Existen comercialmente varios estuches inmunodiagnósticos para detectar antígeno de Giardia en las muestras de materia fecal. La sensibilidad de éstos varía entre el 85 al 98% y la especificidad entre el 90 al 100% (6). Se conoce que la sensibilidad y la especificidad de los métodos depende de la cepa de Giardia circulante en una área geográfica y de la variabilidad genética inherente al parásito (12). La presente investigación informa por primera vez la detección de antígeno de cepas colombianas de Giardia en materia fecal humana, mediante una prueba inmunodiagnóstica como el ELISA, utilizando anticuerpos policlonales específicos de las cepas del parásito circulantes en el país. |
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Objetivos |
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Generales Desarrollar una prueba inmunodiagnóstica para la detección de antígeno de cepas colombianas de Giardia en materia fecal humana. Específicos 1. Establecer metodologías reproducibles para: - Elaborar antígeno de quiste y trofozoíto de cepas colombianas de Giardia. - Producir anticuerpos policlonales anti-quiste y anti-trofozoíto de Giardia. - Elaborar conjugado anti-Giardia. 2. Estandarizar y evaluar el ensayo inmunoenzimático ELISA para la detección de antígeno de Giardia en materia fecal humana. Con respecto a la estandarización: - Determinar la concentración óptima de anticuerpo policlonal anti-Giardia. - Establecer la dilución óptima de conjugado anti-Giardia. Con respecto a la evaluación: - Establecer los parámetros de la prueba inmunoenzimática como son: sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VVP), valor predictivo negativo (VPN). |
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La creación de un protocolo |
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Ya en el entorno perioperatorio, la enfermedad cardíaca es el problema responsable de la mayor y mas seria morbilidad / mortalidad perioperatoria. Por esta razón desde la inauguración de la Clínica Reina Sofía en enero de 1993, el Departamento de Anestesiología ha impulsado el desarrollo e implementación de protocolos de manejo de múltiples patologías. Así ha habido especial interés en que el protocolo de valoración del paciente con enfermedad cardíaca fuera el primero, por la importancia de esta patología, en la incidencia de morbilidad perioperatoria. Por ello en el año 1994, el Departamento de Anestesiología delegó al doctor Ibarra para desarrollar y presentar el protocolo que se discutió y se aprobó en conjunto con los cardiólogos e internistas mas vinculados a la Clínica del cuadro medico de Colsanitas. Este protocolo luego fue adoptado oficialmente por la Dirección Científica en cabeza del Dr. Otto Uscher. (Ver figura 1). Tres años mas tarde el protocolo fue revisado en reunión de Anestesiología con Cardiología y Medicina Interna, adoptándose desde mediados de 1997 a las Guías de la ACC/AHA (American College of Cardiology / Amercan Heart Association) publicado en1996. Este nuevo protocolo fue aceptado por el Director Científico de la Clínica, doctor Hernando Altahona en 1997. Ver Apéndice. Por estar este trabajo en proceso de revisión para publicaciones internacionales se presenta aquí una descripción parcial del trabajo y no una versión completa. Sin embargo, si algún lector deseara conocer más detalles de la investigación no tiene más que remitirse al autor. |
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El estudio |
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En la Clínica Reina Sofía todos los pacientes programdos a cirugía deben ser evaluados en la Consulta Preanestésica del Departamento de Anestesiología, ya sea que tengan o no evaluaciones de Medicina Interna, Cardiología, Neumología, etc. En un período de 30 meses se recolectó prospectivamente toda la información clínica como de las pruebas cardiovasculares que se solicitaron a los pacientes en la Consulta Preanestésica de la Clínica Reina Sofía. Estos pacientes se dividieron en dos grupos: A: Aquellos quienes fueron evaluados según protocolos aprobados ( como se describió arriba) B: Aquellos cuyos interconsultantes no se sometieron a los protocolos. (El protocolo de evaluación cardiaca vigente sirve sólo de guía, no es de mandatorio cumplimiento). Así mismo se recolectó la información de los procedimientos y las complicaciones mayores presentados por los pacientes en la Clínica Reina Sofía. Ante la eventualidad de desarrollar complicaciones que fueran atendidas en instituciones fuera de la Clínica Reina Sofía se registraron todos los eventos que los pacientes operados hubieran tenido en todas las instituciones de Santa Fe de Bogotá. También se previo la posibilidad de deceso perioperatorio no hospitalario y se llevó un registro de todos. Con estas bases de datos, la de Consulta Preanestésica, la de registros quirúrgicos, elaborada y facilitada por el doctor Germán Parra, Gerente de Asonest Ltda; la de la Clínica Reina Sofía, facilitada por el doctor Eduardo Baquero, Jefe de Estadística; y la de todas las demás instituciones de Santa Fe de Bogotá facilitada por el doctor Se analizaron diferentes factores que pudieran asociarse a un riesgo aumentado de desarrollar complicaciones cardiacas como: magnitud de cirugía, antecedente de enfermedad coronaria, hipertensión arterial, sexo, edad, diabetes y arritmias. Respecto a los exámenes se encontró que los no sometidos a protocolo tuvieron una probabilidad de tener un ecocardiograma y una prueba de esfuerzo de 17 veces y 59 veces más, respectivamente. Sin embargo, al hacer análisis estadístico bajo la asesoría de la doctora Martha Delgado, Anestesióloga epidemióloga de la Universidad Javeriana, se encontró, con análisis de regresión logística, que el someter los pacientes al protocolo no se asoció a un aumento de la morbilidad. El sexo, la edad, diabetes e hipertensión tampoco se asociaron a mayor morbilidad cardiaca perioperatoria. En cambio, el tipo de cirugía – mayor o intermedio –, así como la presencia de enfermedad coronaria, sí se asociaron a un mayor riesgo de tener morbilidad cardiaca ( 9, 3 y 4 veces más probable respectivamente). Sin embargo, el riesgo total de tener complicaciones cardiacas perioperatorias en la Clínica Reina Sofía es muy bajo (0,3%), comparable al reportado en publicaciones de prestigiosas publicaciones internacionales. Se concluye que: 1. Con la evaluación preanestésica actual, y el manejo intra y postoperatorio del Departamento de Anestesiología de la Clínica Reina Sofía, la morbilidad cardiaca perioperatoria es muy baja. 2. La aplicación de protocolos para optimizar el proceso de evaluación, y así mismo racionalización de las pruebas cardiacas en cirugía programada en la Clínica Reina Sofía es seguro y no se asocia a aumento de morbilidad. |
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Bibliografía |
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1. Alandete JJ: Comunicación personal. Director Programa de Patologías Crónicas. Bogota: Ministerio de Salud 1998. 2. Eagle KA, Brundage BH, Chaitman BR, Ewy GA, Fleisher LA, Hertzer NR et al. Guidelines for Perioperative Cardiovascular Evaluation for Noncardiac Surgery. Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines (Committee on Perioperative Cardiovascular Evaluation for Noncardiac Surgery). J Am Coll Cardiol 1996; 27(4): 910 - 948. 3. Litalien GJ, Paul SD, Hendel RC, Leppo JA, Cohen MC, Fleisher LA et al.Development and Validation of a Bayesian Model for Perioperative Cardiac Risk Assessment in a Cohort of 1,081 Vascular Surgical Candidates [see comments]. J Am Coll Cardiol 1996; 27(4): 779 - 786. 4. Goldman L, Caldera DL, Nussbaum SR, Southwick FS, Krogstad D, Murray B et al. Multifactorial Index of Cardiac Risk in Noncardiac Surgical Procedures. N Engl J Med 1997; 297(16): 845 - 850. 5. Goldman L: Cardiac Risk for Vascular Surgery [editorial; comment]. J Am Coll Cardiol 1996; 27(4): 799 - 802. 6. Eagle KA, Rihal CS, Mickel MC, Holmes DR, Foster ED, Gersh BJ. Cardiac Risk of Noncardiac Surgery: Influence of Coronary Disease and Type of Surgery in 3368 Operations. CASS Investigators and University of Michigan Heart Care Program. Coronary Artery Surgery Study. Circulation 1997; 96(6): 1882 - 1887 7. Mangano DT, Goldman L. Preoperative Assessment of Patients with Known or Suspected Coronary Disease. N Engl J Med 1995; 333(26): 1750 - 1756. 8. Lee TH, Juarez G, Cook EF, Weisberg MC, Rouan GW, Brand DA, Goldman L. Ruling Out Acute Myocardial Infarction. A Prospective Multicenter Validation of a 12-Hour Strategy for Patients at Low Risk [see comments]. N Engl J Med 1991; 324(18): 1239 - 1246. 9. Warner MA, Shields SE, Chute CG. Major Morbidity and Mortality within 1 Month of Ambulatory Surgery and Anesthesia [see comments]. Jama 1993; 270(12): 1437 - 1441. 10. Bartels H, Stein HJ, Siewert JR. Preoperative Risk Analysis and Postoperative Mortality of Oesophagectomy for Resectable Oesophageal Cancer. Br J Surg 1998; 85(6): 840 - 844. 11. Bode RH Jr, Lewis KP, Zarich SW, Pierce ET, Roberts M, Kowalchuk GJ, Satwicz PR et al. Cardiac Outcome After Peripheral Vascular Surgery. Comparison of General and Regional anesthesia [see comments]. Anesthesiology 1996; 84(1): 3 - 13. 12. Ashton CM. Perioperative Myocardial Infarction with Noncardiac Surgery. Am J Med Sci 1994; 308(1): 41 - 8. 13. Katz NM, Chase GA: Risks of Cardiac Operations for Elderly Patients: Reduction of the Age Factor. Ann Thorac Surg 1997; 63(5): 1309 - 1314. |
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Apéndice |
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Protocolo de evaluación preoperatoria del paciente cardíaco vigente en la Clínica Reina Sofía desde 1997 riesgo alto Protocolo adoptado Clínica Reina Sofía 1997. Riesgo Intermedio |
Pie de tabla 1. jkhdjshf hjfhsdjhf dhf h fdfdsfytry
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